On connait la séquence codante du gène étudier , donc de l’ATG au codon stop.
on ne connait pas les extrémités 5’UTR et 3’UTR de l’ARNm
5′ RACE PCR:
but = amplifier uniquement la région 5’UTR de l’ARNm, en passant par l’ADNc. cela permet ensuite de ne séquencer que cette région au lieu de tout l’ADNc.
Etapes:
- extraction des ARNm totaux
- Ligation spécifique en 5′ de l ARNm d’un oligonucléotide simple brin (exp. polydC)
- retro-transcription en ADNc grace à des amorces polydT
- hydrolyse de l’ARN par une RNase
- PCR avec deux amorces
- 5′–>3′ oligodG
- 3′–>5′ Gene Specific primer GSP au niveau de la séquence codante connue
3′ RACE PCR:
but = amplifier uniquement la région 3’UTR de l’ARNm, en passant par l’ADNc. cela permet ensuite de ne séquencer que cette région au lieu de tout l’ADNc.
Etapes:
- extraction des ARNm totaux
- Ligation spécifique en 5′ de l ARNm d’un oligonucléotide simple brin (exp. polydC)
- retro-transcription en ADNc grace à des amorces polydT
- hydrolyse de l’ARN par une RNase
- PCR avec deux amorces
- 5′–>3′ Gene Specific primer GSP au niveau de la séquence codante connue
- 3′–>5′ oligodT
